一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法,申请号CN201310394181.6-传众专利搜索

一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法

申请公布号：CN103467591B

申请号：CN201310394181.6

申请日期：2013.09.03

申请公布日期：2015.09.09

申请人：

长春海伯尔生物技术有限责任公司

发明人：刘芃实;贺永山;卡特琳娜·阿尔瓦斯;刘长春

分类号：C07K14/555(2006.01)I;C07K1/107(2006.01)I

主分类号：C07K14/555(2006.01)I

代理机构：

深圳市君胜知识产权代理事务所 44268

代理人：王永文;杨宏

地址：130524 吉林省长春市东湖生态经济开发区

摘要：本发明公开了一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，其包括以下步骤：将重组人干扰素浓缩液与活化聚乙二醇溶液混合充分进行偶联反应后，再以pH值为4.5的10mM醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液；将所述偶联反应液通过离子交换层析分离得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰素，将所述单修饰的聚乙二醇干扰素通过切向流超滤系统进行置换缓冲系统的处理，将其置于磷酸钠缓冲液中，最终得到聚乙二醇干扰素蛋白。大幅度增加了修饰效率，实现了蛋白质药物性能的改善，本发明通过特定的偶联反应工艺，有利于偶联产物的后续提纯，提高了目标产品回收率，降低了聚乙二醇干扰素的制造成本。

主权项：一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，其包括以下步骤：A、将重组人干扰素浓缩液与活化聚乙二醇溶液混合充分进行偶联反应后，再以pH4.5的10 mM醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液；B、将所述偶联反应液通过EMD COO<sup>‑ </sup>‑650离子交换层析分离得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰素，将所述单修饰的聚乙二醇干扰素通过切向流超滤进行置换缓冲系统的处理，将其置换于磷酸钠缓冲液中，最终得到聚乙二醇干扰素蛋白；在所述步骤A之前还包括：将重组干扰素原液通过切向流超滤系统浓缩至蛋白浓度为2.0 ‑10.0 mg/ml，再用50mM的硼酸盐缓冲液渗滤，得到所述重组人干扰素浓缩液；所述步骤A具体的包括：将所述活化聚乙二醇溶解于冷却至2℃‑8℃的乙腈溶液中，使其终浓度为40‑80 mg/ml，使所述活化聚乙二醇的量为所述重组人干扰素浓缩液蛋白总量的2‑8倍；所述偶联反应在碱性条件下反应2‑6小时；所述步骤B具体的包括：以2‑6倍的醋酸钠缓冲液平衡上样后的离子交换层析柱，再以含20 mM ‑80mM氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，根据紫外检测仪分段收集洗脱峰，以SDS‑PAGE电泳法检测纯度，得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰素；所述聚乙二醇干扰素电泳纯度明显提高，偶联后的电泳偶联率及蛋白收获率显著提高。