一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的制备方法,申请号CN200910039360.1-传众专利搜索

一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的制备方法

申请公布号：CN101886067A

申请号：CN200910039360.1

申请日期：2009.05.11

申请公布日期：2010.11.17

申请人：

深圳市海普瑞药业股份有限公司

发明人：马小来;李锂;李坦

分类号：C12N9/88(2006.01)I;C12R1/20(2006.01)N

主分类号：C12N9/88(2006.01)I

代理机构：

广州知友专利商标代理有限公司 44104

代理人：宣国华

地址：518057 广东省深圳市南山区松坪山朗山路21号

摘要：本发明提供了一种肝素酶I的制备方法，以肝素黄杆菌为原料，将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养、再接到发酵培养基、离心收集沉淀、沉淀超声破碎、再离心而得到肝素黄杆菌肝素酶I的粗酶液，通过对粗酶液进行三次SP-Sepharose FF层析纯化得到高纯度的肝素黄杆菌肝素酶I。其中三次SP-Sepharose FF层析纯化都由氯化钙全程保护，大大增加了纯酶活性收率。本发明具有工艺简单、容易放大、产品单次制备量大、试剂成本低等特点，制备的肝素酶I比活高达223IU/mg，纯酶活性收率高达30％，与现有最新方法相比，比活增加了两倍多，纯化收率增加将近一倍。

主权项：一种肝素黄杆菌肝素酶I的制备方法，其特征在于：所述方法包括下述顺序步骤，a、将肝素黄杆菌接到50ml种子培养基中，23℃，150rpm，培养1天；b、按5％接种量接入发酵培养基，23℃，150rpm，培养2-3天，4℃，10000rpm，离心15-30分钟，收集沉淀；c、沉淀悬浮在100ml、50mM的含CaCl2的Tris-HCl①缓冲溶液中，冰浴超声1小时，4℃，10000rpm，离心30min，滴加0.5g/ml的鱼精蛋白8ml，搅拌，4℃，10000rpm，离心30min，取上清液；d、上一根用含CaCl2的Tris-HCl①缓冲液平衡过的SP柱，以同样的缓冲液平衡3个柱体积，以含CaCl2的Tris-HCl①缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管；f、洗脱液透析后上一根用含CaCl2的Tris-HCl①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的含氯化钠、肝素Tris-HCl②缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管；g、洗脱液透析后上一根用含CaCl2的Tris-HCl①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，含CaCl2的Tris-HCl①缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，冷冻保藏。